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血标本提取RNA

归档日期:06-13       文本归类:单个核突击      文章编辑:爱尚语录

  在用血液标本进行基因表达研究时,需要及时把新鲜血液中有核细胞的RNA提取出来。全血还不能直接放到-80℃保存,即使在-80℃保存,全血中的RNA也容易发生降解。传统的提取新鲜全血RNA方法是把先把有核细胞从全血中分离出来,需要加白细胞分离液、离心等步骤,比较繁琐,在临床医院往往难以实施,新的RNA提取方法为RN01 TRIpure LS裂解全血提取RNA。

  (1)外周血送检需5-10ml抗凝血,骨髓需1-3ml抗凝,常温送检(样本量根据单个核细胞的数量来确定,一般需要5x106单个核细胞以上)。

  (4)吸取5ml细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面(注意勿与淋巴细胞分离液混合)。离心1500rpm 20min。

  (5)用吸管轻轻吸出界面层(白膜)中的MNC入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次,最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中,离心去上清直接或加入TRIzol混匀后-70℃冻存,或直接提取RNA(可以先进行细胞计数以保证细胞数)。

  (1)血液收集:用肝素抗凝,因为EDTA可能会对后续的pcr有影响,因为EDTA会螯合pcr反应中的Mg2+,也可以根据实验的具体要求看选择怎么样的抗凝。

  (2)白细胞的分离:一般选择1.5ML新鲜的血液,或选取冷冻的5ML的血液(冷冻血液的保存:先液氮速冻,再置于-80保存),或隔天的5ML的血液,就可以分离到比较多的白细胞了。可以选择溶红素或红细胞裂解液按一定的比例(1:3或1:5)分离白细胞,一般在3500转离心6分钟即可,效果不好的话,可以重新裂解一次。

  (3)分离得到的白细胞,立刻用质量好的TRIZOL裂解白细胞,如果不能马上提取的线保存,过后抽提(选择一般的组织或细胞的RNA抽提ELISA试剂盒即可)。

  液体样本RNA提取试剂RN01 TRIpure LS。可以直接裂解全血提取RNA,避免了先裂解白细胞可能导致的RNA降解,也大大简化了操作步骤。操作时间比普通方法节约至少三分之一。

  (2)血液样本可以先抗凝处理(EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可),然后取250ul全血样品加入到750ul的TRI pure LS Reagent中,用移液枪反复抽打并振荡混匀,在室温裂解5min-10min,直至血细胞充分发生裂解。

  (3)此裂解液保存在-20℃下可达2个月,-80℃可达半年,4℃可以1天。

  (4)样品在15 -30C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

  (5)每1ml TRIpure加0.2mllv仿,盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒并将其在室温下孵育2~3分钟。在2~8C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层:下层苯酚-lv仿层,中间层,上层无色的水样层。RNA在于水样层,水样层的容量大约为所加TRIpure 容量的60%。

  (6)将水样层转移到新EP管中(如果希望分离DNA和蛋白,有机层同样要予以保留),最初均化时的每1ml TRIpure 对应0.5ml异丙醇,将混合的样品在-15 -30C条件下孵育10分钟;

  (7)在2~8C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟(RNA沉淀在离心前通常不可见,形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底;

  (8)移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次(每1ml的TRIpure 至少加1ml的75%乙醇),在2~8C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟;

  (9)简单干燥RNA沉淀(空气干燥或线分钟,不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性)。部分溶解的RNA样品其A260/280比值1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5%SDS溶液来溶解RNA,RNA还能被100%甲酰胺(除去离子)再溶解并保存在70C;

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