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单个核细胞分离

归档日期:07-22       文本归类:单个核突击      文章编辑:爱尚语录

  单个核细胞的分离 实验目的 1.熟悉免疫细胞分离的常用方法。 2.掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、 操作规程。 免疫系统 免疫器官 免疫细胞 免疫分子 外周血细胞成分 ?淋巴细胞 ?单核细胞 ?粒细胞 ?红细胞和血小板 不同细胞密度不同 ?人的红细胞密度为1.093 ?粒细胞密度为1.092 ?单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的密度为 1.075-1.090 ?血小板:1.030~1.035 细胞分离基本原理 ?不同细胞密度不同 ?不同细胞表面生物学特性不同 ?不同细胞表面分化抗原不同 ?人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴细胞和单 核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。 【实验原理】 人外周血单个核细胞的体积、形态和 比重与外周血其他细胞不同。因此利用一 种介于1.075~1.090之间而近于等渗的聚 蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque 比重 1.077±0.001 )混合分离液作密度梯度离 心,离心后不同比重的血细胞在分离液中 呈梯度分布。从而分离出PBMC。 Ficoll分层液 ? 聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为Ficoll ,其密度为 1.077±0.001。 主要用于分离外周血中的单个核细胞,是一 种单次差速密度梯度离心的分离法。 其主要成分:2份浓度为6℅、密度为1.020 g/L聚蔗糖(商品名为Ficoll )与1份浓度为34℅、 密度为1.200 g/L泛影葡胺水溶液混合。 用1.077±0.001的分层液可将细胞分离 密度梯度离心(Ficoll)离心 试剂与器材 ? 1 . 标 本 外 周 静 脉 血 加 EDTA-K2 抗 凝 , 或 1000U/ml肝素抗凝血。 ? 2. 淋巴细胞分离液(聚蔗糖 - 泛影葡胺,比重 (1.077±0.001)有商品供应。 ? 3.Hanks液 ? 4.台盼蓝染液 ? 5.器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。 操作方法 ? 1. 取静脉血放入抗凝管,摇匀,先作白细胞计数,然 后取1.5ml加入等量Hank液,混匀。 ? 2.取1.5ml Ficoll分离液置于灭菌离心管内,用毛细吸 管将稀释血液3ml沿管壁徐徐加入离心管,使稀释血液 重叠于淋巴细胞分离液上(分层液与稀释血液体积比 例为1:2),二者之间有一明显的界面。 ? 3.用水平离心机以2000r/min离心20min,离心 后管内容物分为四层,上层为血浆(内含血小 板),中间层为分离液,底层为红细胞和多形 白细胞,在上、中层液体界面处可见到乳白色 浑浊的单个核细胞层 ? 4.用毛细吸管轻轻插到白膜层,沿试管壁周缘 吸取该层单个核细胞,移入EP管,2000r /min 5min离心去血浆, ? 加 1mlHanks混匀,2000r/min离心5min,弃上 清液。 ? 5.末次离心后,吸尽上清后,将细胞悬液体积 用 Hanks 还原至 1ml,取一滴细胞悬液置血细 胞计数板内计数,计算单个核细胞的回收率。 ×100% 单个核细胞回收率= 分离后细胞悬液ml×每毫升单个核细胞数 全血ml数×全血中每毫升单个核细胞数 单个核细胞数/1毫升细胞悬液)= 4个大方格内细胞总数 ───────── ×10 × 103×2(稀释倍数) 4 6.细胞活力检测 ? 取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀,加盖玻 片,显微镜高倍镜观察。 细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个单个细胞 数 结果判断 ? 活细胞不着色,折光强,由于染料可渗入死亡 细胞被染成蓝色,体积略膨大。正常情况下, 活细胞应在95%以上。 实验讨论 ? 1. 注意事项①将稀释的血液加分层液上 时,一定要细心,动作要轻,使分离液 与血液的界面清楚,避免冲散分层液面 或与分层液混合影响分离结果。 ? ②分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要 使用不同比重的分层液,分离人血所用分层液 的比重以1.077±0.001为好;小鼠为1.088,而 马则为1.090。 ? ③配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗, 有缓冲作用,并对细胞无毒性 方法评价 ? 密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用 方法, ? 用该方法不能除去其中的单核细胞。 临床意义 ? 分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要, 可用于细胞的分类鉴定,及各种功能,也可用 于进一步纯化淋巴细胞,分离单个核细胞技术 是进行细胞免疫试验的重要技术之一。

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